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黄曲霉毒素总量(AFT)ELISA检测试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品，操作时间35~40min，能限度地减少操作误差和工作强度。
【产品介绍】
黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。薄层色谱一直是检测黄曲霉毒素常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉毒素总量ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素残留。
黄曲霉毒素总量(AFT)ELISA检测试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品，操作时间35~40min，能限度地减少操作误差和工作强度。
【试验原理】
黄曲霉毒素总量(AFT)ELISA检测试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被黄曲霉毒素抗原，样本中黄曲霉毒素和此抗原竞争黄曲霉毒素的抗体，酶标二抗催化TMB底物显色，样本吸光值与其含有的黄曲霉毒素成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中黄曲霉毒素的含量。
【适用范围】
黄曲霉毒素总量(AFT)ELISA检测试剂盒可定性、定量检测玉米、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素。
【交叉反应率】
黄曲霉毒素B2……………………………………………
黄曲霉毒素B1…………………………………………97%
黄曲霉毒素G1…………………………………………98%
黄曲霉毒素G2…………………………………………101%
【使用单位需自备的设备及试剂】
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅振荡器
┅┅涡旋仪
┅┅离心机
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅漏斗
┅┅分液漏斗
┅┅烧杯:50ml
┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml
┅┅微量移液器：单道 20l～200l、200l～1000l
多道 250l
┅┅滤纸
试剂：
┅┅甲醇
----去离子水
----石油醚(或正己烷)
【提供的材料与试剂】
组份名称 96T装量 48T装量 备注
酶标板 96T 48T 其它各规格装量按比例增加或减少，具体装量以实物为准。
标准品×6瓶* 1ml/瓶 0.5ml/瓶
AFT酶标物 9ml 5ml
AFT抗试剂 6ml 3ml
底物液A液 9ml 5ml
底物液B液 9ml 5ml
终止液 6ml 3ml
浓缩洗涤液(10×) 40ml 20ml
*注：标准品浓度为0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
【溶液的配制】
配液1: 洗涤工作液
用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1:9体积比进行稀释，即1份浓缩洗涤液加9份去离子水，用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
配液2: 样品提取液1
用去离子水将甲醇按3:2体积比进行稀释，即3份甲醇加2份去离子水，用于提取样本中的黄曲霉毒素。
配液3: 样品提取液2
用去离子水将甲醇按7:3体积比进行稀释，即7份甲醇加3份去离子水，用于提取样本中的黄曲霉毒素。
【样本前处理步骤】
(一)花生处理方法
┅┅取10g粉碎样品，加入30ml样品提取液1;
┅┅剧烈振荡5min;
┅┅3500r/min离心5min，或用普通滤纸过滤;
┅┅用去离子水按1:5比例稀释(1份滤液+5份去离子水);
┅┅取稀释后液体待测。
稀释倍数：18
(二)饲料、玉米处理方法
┅┅取3g粉碎样品，加入15mL样品提取液2;
┅┅剧烈振荡10min;
┅┅3500r/min离心5min，或用普通滤纸过滤;
┅┅上清液或滤液用去离子水按1:6比例稀释(1份滤液+6份去离子水);
┅┅取稀释后液体待测。
稀释倍数：35
(三)食用油处理方法
┅┅取5g食用油样品于小烧杯中;
┅┅用10mL石油醚(或是正己烷)分次将试样转移至125mL分液漏斗中;
┅┅准确加入15mL 样品提取液1，加塞振荡5分钟，静置分层，放出下层甲醇水提取液;
┅┅用去离子水按1:5比例稀释(1份滤液+5份去离子水);
┅┅取稀释后液体待测。
稀释倍数：18
【检测步骤】
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温(20～25℃)。
2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
5、黄曲霉毒素可致癌，应戴手套操作。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。不要冷冻。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加标准品/样本30l到对应的微孔中，再加入黄曲霉毒素总量酶标物70l/孔，加入黄曲霉毒素总量抗试剂50l/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300l/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。
7、显色：加入底物液A液75l/孔，再加底物液B液75l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应15min~20min。
8、测定：加入终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止用目测法可进行判定)。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，而定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含黄曲霉毒素成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.659，样本2的吸光度值为1.525，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.101;0.1ppb为1.738;0.3ppb为1.313;0.9ppb为0.831;2.7ppb为0.469;8.1ppb为0.262。则样本1的浓度范围是0.9ppb～2.7ppb;样本2的浓度范围是0.1ppb～0.3ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中黄曲霉毒素的浓度范围。
2、定量分析
(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以个标准(0标准)的吸光度值，再乘以，即
百分吸光度值(%)= B ×/B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
(2)标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素标准品浓度(ppb)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素实际量。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。(欢迎来电索取)
【检测方法灵敏度、准确度、精密度】
试剂盒灵敏度：0.1ppb
回收率：
花生：95±15%
饲料：85±15%
玉米：90±15%
食用油：95±15%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
【注意事项】
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20～25℃)会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件
保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
9、浓缩洗涤液如有结晶属正常现象，请加热溶解后使用。
10、该试剂盒反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。